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异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制初步研究

韩双双 谭周倩 黄晓德 钱骅 陈斌 赵伯涛 陈双林 闫淑珍

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异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制初步研究

    作者简介: 韩双双,女,硕士研究生,E-mail:18315913417@163.com.
    通讯作者: 赵伯涛, zbt_nj@163.com
  • 中图分类号: TQ450.12; Q965.9

Preliminary study on the action mechanism of ally isothiocyanate against Bursaphelenchus xylophilus

    Corresponding author: Botao ZHAO, zbt_nj@163.com ;
  • CLC number: TQ450.12; Q965.9

  • 摘要: 对异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制进行了初步研究。测定了其对线虫虫体形态、运动行为、体内总糖和蛋白质含量的影响,以及处理前后线虫体内过氧化氢酶 (CAT)、乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 活性变化。结果表明:经异硫氰酸丙烯酯处理后的松材线虫虫体形态严重扭曲,运动形态出现由正常的S形变化为多节弯曲和螺旋状卷曲等异常状况,线虫行动随时间的推移变得迟缓,最终呈C形、新月形或直接死亡。随着异硫氰酸丙烯酯处理质量浓度的增大,线虫体内总糖和蛋白质含量显著上升,糖和蛋白质的代谢发生紊乱;线虫体内CAT、AChE和GST活性显著降低,且均低于对照组,表明线虫体内氧化和抗氧化作用失衡;细胞受到极大的影响,神经系统遭到破坏,解毒能力明显降低。研究结果可为研究利用异硫氰酸丙烯酯作为植物源杀线虫剂提供依据。
  • 图 1  10.6 μg/L的异硫氰酸丙烯酯处理不同时间松材线虫的形态变化

    Figure 1.  Morphological changes of Bursaphelenchus xylophilus after the treatment by 10.6 μg/L AITC at different times

    图 2  松材线虫组织结构形态改变示意图

    Figure 2.  Morphological changes of B. xylophilus

    图 3  不同质量浓度的异硫氰酸丙烯酯对松材线虫运动行为的影响

    Figure 3.  Behavior of B. xylophilus treated by AITC of different concentrations

    表 1  异硫氰酸丙烯酯对松材线虫体内总蛋白和总糖含量的影响

    Table 1.  Total protein and sugar of B. xylophilus treated by AITC of different concentrations

    异硫氰酸丙烯酯质量浓度
    Concentrationof AITC /(μg/L)
    总蛋白质 Total protein总糖 Total sugar
    含量 Content/(mg/mL)比值 Ratio含量 Content/(μg/mL)比值 Ratio
    31.8 0.64±0.02 a** 1.64 29.31±0.001 a** 1.73
    5.2 0.56±0.005 b* 1.43 28.06±0.004 b* 1.66
    CK 0.39±0.01 c 1 16.92±0.02 c 1
    注:表中数据为3次重复的平均值 ± 标准差。同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)。*表示与对照相比差异显著 (P<0.05),**表示与对照相比差异极显著 (P<0.01)。Note: Each value is the mean (averages of three replications) ± SE. Different lowercase at the same column data showed significant differences between the different treatments(P<0.05). * Indicates that the difference is significant compared with the control (P<0.05), and ** indicates that the difference is extremely significant compared with the control (P<0.01).
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    表 2  异硫氰酸丙烯酯对松材线虫体内酶活性的影响

    Table 2.  Effect of AITC on enzyme activities in B. xylophilus

    异硫氰酸丙烯酯质量浓度
    Concentration of AITC/(μg/L)
    酶活性 Activity of enzyme/(U/mg)
    CAT AChE GST
    31.8 51.18±0.03 c** 0.372±0.002 c** 2.86±0.03 c**
    5.2 60.39±0.25 b* 0.423±0.004 b* 4.92±0.02 b*
    CK 83.20±0.07 a 0.822±0.002 a 17.05±0.05 a
    注:表中数据为3次重复的平均值 ± 标准差。同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)。*表示与对照相比差异显著 (P<0.05),**表示与对照相比差异极显著 (P<0.01)。Note: Each value is the mean (averages of three replications) ± SE. Different lowercase at the same column data showed significant differences between the different treatments(P<0.05). * Indicates that the difference is significant compared with the control (P<0.05), and ** indicates that the difference is extremely significant compared with the control (P<0.01).
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-09-05
  • 网络出版日期:  2019-08-15
  • 刊出日期:  2020-02-01

异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制初步研究

    通讯作者: 赵伯涛, zbt_nj@163.com
    作者简介: 韩双双,女,硕士研究生,E-mail:18315913417@163.com
  • 1. 南京师范大学 生命科学学院,南京 210023
  • 2. 南京野生植物综合利用研究院,南京 211100

DOI: 10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0073

摘要: 对异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制进行了初步研究。测定了其对线虫虫体形态、运动行为、体内总糖和蛋白质含量的影响,以及处理前后线虫体内过氧化氢酶 (CAT)、乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 活性变化。结果表明:经异硫氰酸丙烯酯处理后的松材线虫虫体形态严重扭曲,运动形态出现由正常的S形变化为多节弯曲和螺旋状卷曲等异常状况,线虫行动随时间的推移变得迟缓,最终呈C形、新月形或直接死亡。随着异硫氰酸丙烯酯处理质量浓度的增大,线虫体内总糖和蛋白质含量显著上升,糖和蛋白质的代谢发生紊乱;线虫体内CAT、AChE和GST活性显著降低,且均低于对照组,表明线虫体内氧化和抗氧化作用失衡;细胞受到极大的影响,神经系统遭到破坏,解毒能力明显降低。研究结果可为研究利用异硫氰酸丙烯酯作为植物源杀线虫剂提供依据。

English Abstract

  • 松材线虫病又名松材线虫萎焉病、松树萎焉病和松树枯萎病,被称为“松树的癌症”[1-2],因其危害严重和防治困难受到世界各国的重视。截至目前,尚未发现能有效防治松材线虫且相对环保的药物[3],因此开发对人类和环境友好型杀松材线虫剂成为重要的研究任务[4]

    植物源农药具有毒性较低、且大多作用后无残留或残留较少、与环境相容性好以及害虫不易产生抗性等优点[5],符合绿色环保的要求,近年来在防治农业病虫害防治方面发展迅速。翁群芳等采用28种植物提取物进行杀线虫试验,发现了多种具有一定杀线活性的物质,并对其生理活性和生理效应进行了初步研究[6]。目前,研究主要集中在杀线虫植物的调查及筛选等方面,有关其杀线虫的机理还不是很清楚。本研究拟测定异硫氰酸丙烯酯对松材线虫虫体形态、运动行为、体内的总糖、蛋白质含量及相关酶活性的影响,以期为异硫氰酸丙烯酯作为杀线制剂的进一步研究和应用提供参考。

    • 异硫氰酸丙烯酯 (allyl isothiocyanate, AITC),纯度98%,由南京野生植物综合利用研究院自行制备。

      松材线虫Bursaphelenchus xylophilus,由南京师范大学微生物实验室提供。松材线虫用以PDA培养基培养的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea饲养 (25 ℃),至线虫长满平板,置于4 ℃保存。使用时先将含有线虫的培养基挑出,放入贝氏漏斗中,无菌水冲洗,将流出液浓缩配制成100条/μL的线虫液[7]

    • 将200 μL(216.3 mg) 异硫氰酸丙烯酯溶于1 800 μL二甲基亚砜 (DMSO) 中,配制得质量浓度为16 000 mg/L的母液;将200 µL无菌水溶于1 800 µL DMSO中,得对照组的母液。

      用无菌水将异硫氰酸丙烯酯母液稀释至10.6 μg/L,同法稀释对照组母液。取1 mL两种稀释液分别处理松材线虫2、4、8、24、48和72 h[8],每处理设置3个重复,采用光学显微镜100倍放大观察,拍照。每个时间段重复取样3次。

    • 当松材线虫在长满灰葡萄孢菌的平皿上生长6 d时,将其用贝尔曼漏斗法收集,并用无菌水反复冲洗直至透明。将线虫分别转移至空白和分别含有10.6、5.3、2.65、1.325 μg/L异硫氰酸丙烯酯稀释液的2 mL离心管中,置于25 ℃恒温培养箱培养2 h。将处理过的松材线虫转移到滴有无菌水的载玻片上,显微镜下计数,以确定1 min内线虫头部摆动的次数 (当线虫身体弯曲达到体长的一半时作为1次头部摆动) 和身体弯曲的次数,每组测定10条线虫[9]

    • 前期研究采用浸渍法,测得异硫氰酸丙烯酯对松材线虫处理24 h的半数致死浓度 (LC50) 为27.4 μg/L。本研究同样采用浸渍法,分别选择质量浓度接近LC50值的31.8 μg/L和低于LC50值的5.2 μg/L的异硫氰酸丙烯酯稀释液处理松材线虫 (约1 × 105条),同时以无菌水处理为对照,每处理重复3次,置于25 ℃培养箱暗培养2 h。

    • 将浸渍处理后的线虫于3 000 r/min下离心4 min,所得沉淀用无菌水反复冲洗、离心 (3 000 r/min,4 min) 3次。除去上清液,称量线虫质量。将沉淀 (线虫) 置于预冷的灭菌匀浆器中,加入质量分数为0.86%的冷生理盐水 (生理盐水的体积是线虫质量的9倍)。冰上匀浆10 min。在4 000 r/min下离心10 min,取上清液,得到质量体积比为10%的组织匀浆液。

    • 采用蒽酮法[10]测定松材线虫体内的总糖含量,采用紫外分光光度计在波长为620 nm处测定吸光值;采用考马斯亮蓝G250染色法[11]测定蛋白质含量,利用紫外分光光度计在波长为595 nm处测定吸光值。

    • 采用南京建成生物工程研究所生产的过氧化氢酶 (CAT) 测试盒、乙酰胆碱酯酶 (AChE) 测试盒和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 测试盒,按照说明书进行测定。分别根据公式 (1)~(3) 计算CAT、AChE和GST的酶活性。

      $ {L_{\rm{C}}} = \left( {{O_{{\rm{CK}}}} - {O_{\rm{C}}}} \right) \times 271 \times 1/60 \times {T_{\rm{C}}} \div {P_{\rm{C}}} $

      (1)

      $ L_{\mathrm{A}}=\left(O_{\mathrm{A}}-O_{\mathrm{CK}}\right) /\left(O_{\mathrm{B}^{-}} O_{0}\right) \times I_{\mathrm{A}} \div P_{\mathrm{A}} $

      (2)

      $ {L_{\rm{G}}} = \left( {{O_{{\rm{CK}}}} - {O_{\rm{G}}}} \right)/{O_{{{\rm{G}} }}}-{O_0} \times {I_{\rm{G}}} \times 6 \div 10 \div \left[ {{T_{\rm{G}}} \times {P_{\rm{G}}}} \right] $

      (3)

      式中:O为线虫组织匀浆液OD值,其中下标CK为对照;C为检测CAT活性测定组的相关数据;A为检测AChE活性测定组的相关数据;B为检测AChE组中标准液;0为空白;G为检测GST活性测定组的相关数据。L为酶活力 (U/mg);T为取样量 (μL);P为线虫匀浆液蛋白浓度 (mg/mL);I为标准品浓度 (1 μmol/mL)。

    • 采用Excel绘制图表,采用Microsoft Excel 2010对数据进行处理,利用SPSS软件中ANOVA方法对试验数据进行方差分析,并用Duncan’s新复极差法比较数据之间的差异显著性。

    • 经10.6 μg/L的异硫氰酸丙烯酯溶液处理不同时间后松材线虫的形态观察结果如图1所示。对照组结果,线虫体态自然,呈S型自然摆动,虫体内容物分布均匀,结构完整,状态活跃 (图1A)。经异硫氰酸丙烯酯处理2 h后的线虫虫体形态严重扭曲,出现蜷缩状,呈“ξ”形,线虫行动缓慢,虫体发颤 (图1B);处理4 h后,线虫蜷缩不动,呈“ω”形 (图1C);处理8 h后,大部分线虫蜷缩不动或动作缓慢发颤,少部分线虫僵直,呈新月形或者C形 (图1D);处理24 h后,大部分线虫呈新月形或者C形僵死,少部分线虫蜷缩,行动缓慢发颤 (图1E);处理48 h后几乎所有线虫都呈新月形或者C形僵死,只有极个别线虫身体会微微颤动 (图1F);处理72 h后,所有线虫都呈弯月形或者C形僵死 (图1G)。部分经异硫氰酸丙烯酯处理后死亡的线虫体内出现不同程度的组织收缩溶解、体壁分离等症状 (图2)。

      图 1  10.6 μg/L的异硫氰酸丙烯酯处理不同时间松材线虫的形态变化

      Figure 1.  Morphological changes of Bursaphelenchus xylophilus after the treatment by 10.6 μg/L AITC at different times

      图 2  松材线虫组织结构形态改变示意图

      Figure 2.  Morphological changes of B. xylophilus

    • 图3结果可以看出,异硫氰酸丙烯酯对松材线虫的运动行为有显著影响,与对照组相比,各处理组的线虫的头部摆动和身体弯曲频率均有所降低,且随药剂质量浓度的增加头部摆动频率呈下降趋势,存在显著差异。表明异硫氰酸丙烯酯对松材线虫的运动能力具有抑制作用。

      图 3  不同质量浓度的异硫氰酸丙烯酯对松材线虫运动行为的影响

      Figure 3.  Behavior of B. xylophilus treated by AITC of different concentrations

    • 结果 (表1) 表明:经5.2 μg/L的异硫氰酸丙烯酯药液处理2 h后,松材线虫体内总蛋白含量增高,由正常培养情况下的0.39 mg/mL增加至0.56 mg/mL;线虫体内总糖含量增高,由正常培养情况下的16.92 μg/mL增至28.06 μg/mL;均达显著水平。31.8 μg/L药液处理2 h后,蛋白含量増至0.64 mg/mL,总糖含量增至29.31 μg/mL,差异性均极显著。这说明异硫氰酸丙烯酯处理松材线虫能够影响线虫体内的蛋白代谢平衡,使线虫体内的蛋白代谢紊乱;并且影响线虫体内的糖代谢平衡,抑制线虫体内的糖酵解过程,进而影响线虫正常的生命活动。

      表 1  异硫氰酸丙烯酯对松材线虫体内总蛋白和总糖含量的影响

      Table 1.  Total protein and sugar of B. xylophilus treated by AITC of different concentrations

      异硫氰酸丙烯酯质量浓度
      Concentrationof AITC /(μg/L)
      总蛋白质 Total protein总糖 Total sugar
      含量 Content/(mg/mL)比值 Ratio含量 Content/(μg/mL)比值 Ratio
      31.8 0.64±0.02 a** 1.64 29.31±0.001 a** 1.73
      5.2 0.56±0.005 b* 1.43 28.06±0.004 b* 1.66
      CK 0.39±0.01 c 1 16.92±0.02 c 1
      注:表中数据为3次重复的平均值 ± 标准差。同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)。*表示与对照相比差异显著 (P<0.05),**表示与对照相比差异极显著 (P<0.01)。Note: Each value is the mean (averages of three replications) ± SE. Different lowercase at the same column data showed significant differences between the different treatments(P<0.05). * Indicates that the difference is significant compared with the control (P<0.05), and ** indicates that the difference is extremely significant compared with the control (P<0.01).
    • CAT和GST是线虫体内与解毒相关的酶,AChE是和线虫运动行为相关的酶,检测这3种酶的活性可以间接反映线虫的生命活动。本研究结果 (表2) 表明:经异硫氰酸丙烯酯处理后,线虫体内保护性酶均有明显变化;与对照水平相比,处理组线虫体内CAT、AChE与GST的活性均有所降低,其中对GST的降低程度最为明显。表明异硫氰酸丙烯酯能够使线虫体内的保护系统失去作用,从而使活性氧浓度失衡,造成虫体损伤;同时能使线虫体内各组织器官运动功能发生变化,使线虫运动神经系统发生紊乱,影响线虫正常的摄食排泄活动。

      表 2  异硫氰酸丙烯酯对松材线虫体内酶活性的影响

      Table 2.  Effect of AITC on enzyme activities in B. xylophilus

      异硫氰酸丙烯酯质量浓度
      Concentration of AITC/(μg/L)
      酶活性 Activity of enzyme/(U/mg)
      CAT AChE GST
      31.8 51.18±0.03 c** 0.372±0.002 c** 2.86±0.03 c**
      5.2 60.39±0.25 b* 0.423±0.004 b* 4.92±0.02 b*
      CK 83.20±0.07 a 0.822±0.002 a 17.05±0.05 a
      注:表中数据为3次重复的平均值 ± 标准差。同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P<0.05)。*表示与对照相比差异显著 (P<0.05),**表示与对照相比差异极显著 (P<0.01)。Note: Each value is the mean (averages of three replications) ± SE. Different lowercase at the same column data showed significant differences between the different treatments(P<0.05). * Indicates that the difference is significant compared with the control (P<0.05), and ** indicates that the difference is extremely significant compared with the control (P<0.01).
    • 本研究测定了异硫氰酸丙烯酯对松材线虫形态变化、运动能力及线虫体内总糖、蛋白质含量以及相关酶活性的影响,拟从线虫表观效应和酶学变化等不同角度探究该物质杀灭松材线虫可能的作用机理。结果表明:经异硫氰酸丙烯酯处理后,松材线虫的头部摆动、身体弯曲频率降低,虫体表现出异常扭曲情况,主要表现为发颤、卷曲、蜷缩、僵直和僵死等状态。表明异硫氰酸丙烯酯对松材线虫的运动性能存在抑制作用,该结果与许云等报道的芫花素对秀丽杆线虫Caenorhabditis elegans运动行为影响的研究结果相一致[12]。昆虫运动行为主要受神经系统控制,而神经系统是机体在结构和功能上最为复杂的系统之一,由于该系统自身的特点,神经毒性表现往往呈现为全身效应。

      松材线虫体表具有一层由脂质蛋白组成的角质层,可起到防御细菌或有害物质入侵、阻止水分蒸发等作用,从而对线虫起到保护作用[13]。本研究结果发现,经异硫氰酸丙烯酯处理后死亡的线虫体内出现组织收缩溶解、体壁分离等症状,这可能是由于异硫氰酸丙烯酯抑制了线虫体内蛋白质的正常代谢,进而抑制蛋白角质层的正常功能,最终导致线虫死亡。糖类是生命体提供生命活动所需能量的重要来源,早已证明线虫体内含有多种糖类物质[14],总糖含量的升高说明线虫体内正常的糖代谢过程受到抑制,生命活动所需能量得不到补充,进而影响线虫的正常生命活动的进行。

      自由基具有很强的生物活性,很容易与生物大分子反应,直接损害或者通过一系列氧化链式反应引起广泛的生物结构破坏,导致细胞凋亡[15-16]。生物体内的CAT能够清除自由氧自由基,从而保证体内的活性氧浓度平衡。因此检测线虫体内CAT的活性可以间接反映体内氧自由基水平[17]。GST是一类与肝脏解毒有关的酶,催化谷胱甘肽与化学物质的亲电子基团结合,最终形成硫醚氨酸排出体外,在体内解毒功能上起重要作用[18]。经异硫氰酸丙烯酯处理后,线虫体内的CAT和GST活性降低,致使线虫体内的氧自由基得不到及时的清除、代谢毒素体内积累,可能会使线虫体内的氧化与抗氧化作用失衡,细胞功能受到极大的影响,最终导致线虫死亡。这一研究结果与杨静等[19]研究的牛心朴子对线虫体内保护性酶及GST活性降低的结果相一致。

      运动是昆虫的一种神经行为,乙酰胆碱作为线虫的一种重要神经递质,常见于中枢及周边神经系统中,参与自主神经系统及虫体运动神经系统的神经传导,调节肌肉活动[20-22]。AChE能在胆碱神经突触处快速催化水解乙酰胆碱变为乙酸和胆碱,从而终止神经冲动的传递[23-25]。因此检测线虫体内AChE的活性可以间接反映线虫运动能力及神经冲动传递能力。当AChE受到抑制时,乙酰胆碱在突触内聚集,先引起突触后膜乙酰胆碱受体的高度兴奋,然后产生极化作用,导致虫体麻痹[26]。据报道,当前防治甘薯茎线虫的主要药剂为AChE抑制剂,如涕灭威、灭线磷等[27-28];李华义等的研究表明,玫瑰黄链霉菌Streptomyces roseoflavus对黄瓜根结线虫AChE活性也具有抑制作用[29-30]。本研究发现,异硫氰酸丙烯酯处理后的松材线虫AChE活性降低,这一结果与测定的线虫运动行为变化结果相一致。

      综上所述,异硫氰酸丙烯酯对线虫体内各项生理指标均有不同程度的抑制作用,这说明异硫氰酸丙烯酯对松材线虫的致死作用有可能是综合性的,是通过影响线虫体内正常的蛋白质的表达水平和糖代谢水平,进而影响线虫体内生命活动相关酶活性的变化,它们之间相互关联和相互影响。在今后的研究中可以对线虫体内各种生命活动相关酶的活性变化进行测定,并且从分子角度探究这3种酶表达量变化的原因及机制,从而对异硫氰酸丙稀酯杀线虫机制做更深入研究。

参考文献 (30)

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