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防治白菜根肿病的新型海洋微生物农药——解淀粉芽孢杆菌Txc2-1可湿性粉剂配方优化及药效研究

张致军 罗远婵 章真 李淑兰 田黎 杨佩文 李元广

引用本文:
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防治白菜根肿病的新型海洋微生物农药——解淀粉芽孢杆菌Txc2-1可湿性粉剂配方优化及药效研究

    作者简介: 张致军,男,硕士研究生,E-mail:997624237@qq.com.
    通讯作者: 李元广, ygli@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: TQ450.6;S482.292

Formulation optimization of the wettable powder of Bacillus amyloliquefaciens: a novel marine microbial pesticide for the control of cabbage clubroot

    Corresponding author: Yuanguang LI, ygli@ecust.edu.cn
  • CLC number: TQ450.6;S482.292

  • 摘要: 根肿病是十字花科作物的全球性重大病害之一,但可供选择的防治药剂非常有限。以本课题组筛选出的一株对十字花科白菜根肿病具有显著拮抗作用的海洋生境芽孢杆菌Txc2-1为研究对象,通过对载体和助剂的筛选以及采用混料设计确定Txc2-1可湿性粉剂最优配方,同时运用制备的30亿CFU/g可湿性粉剂进行盆栽试验和田间药效的考察。结果表明:Txc2-1可湿性粉剂最佳载体为轻质碳酸钙,最佳润湿剂为十二烷基硫酸钠,最佳悬浮剂为聚乙烯醇 (PVA),这3种物质与Txc2-1菌株有较高的生物相容性,且具有良好的理化性能。通过混料设计确定其最优配比为m (轻质碳酸钙):m (十二烷基硫酸钠):m (PVA) = 83 : 9 : 8。利用5 L罐培养液及上述配方进行喷雾干燥获得了30亿CFU/g Txc2-1可湿性粉剂 (Txc2-1 WP);进一步盆栽 (40 d) 和田间 (60 d) 药效试验结果表明,Txc2-1 WP对白菜根肿病的防效分别达70.53%和66.84%。该解淀粉芽孢杆菌Txc2-1可湿性粉剂达到了国家质量标准,对白菜根肿病具有良好的防治效果,本研究结果为将Txc2-1开发成首个防治根肿病的海洋微生物杀菌剂奠定了基础。
  • 图 1  极端顶点设计

    Figure 1.  Extreme vertex design

    图 2  润湿时间与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线图

    Figure 2.  Contour map of wetting time affected by SDS and PVA

    图 3  pH与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线

    Figure 3.  Contour map of pH affected by SDS and PVA

    图 4  悬浮率与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线图

    Figure 4.  Contour map of suspensibility affected by SDS and PVA

    图 5  解淀粉芽孢杆菌制剂多指标配方优化区域

    Figure 5.  Optimization area of multi-index formula for the preparation of B. amyloliquefaciens

    表 1  载体对Txc2-1制剂理化性能的影响

    Table 1.  Effect of carriers on physicochemical properties of Txc2-1 WPs

    序号
    No.
    载体
    Carrier
    细度
    Fineness (≤ 44 μm)/%
    悬浮率
    Suspensibility/%
    润湿时间
    Wetting time/s
    活菌量
    Vable count/(109 CFU/g)
    1轻质碳酸钙
    Light calcium carbonate
    98.1 ± 0.1 a52.95 ± 2.43 a195 ± 4 b2.39 ± 0.29 a
    2高岭土
    White clay
    98.2 ± 0.3 a40.35 ± 1.13 c237 ± 9 c2.42 ± 0.24 a
    3羟基纤维素
    Hydroxycellulose
    90.2 ± 0.1 b56.82 ± 2.18 a160 ± 3 a2.62 ± 0.28 a
    4硅藻土
    Diatomaceous earth
    98.4 ± 0.2 a47.39 ± 0.77 b215 ± 8 c2.58 ± 0.11 a
    注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
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    表 2  助剂对Txc2-1制剂理化性能的影响

    Table 2.  Effects of additives on physicochemical properties of Txc2-1 WPs

    序号
    No.
    助剂
    Agent
    悬浮率
    Suspensibility/%
    润湿时间
    Wetting time/s
    活菌量
    Vable count/(109 CFU/g)
    1 PEG8000 50.42 ± 0.63 d 108 ± 3 b 2.29 ± 0.04 a
    2 PEG6000 51.61 ± 1.13 d 108 ± 4 b 2.30 ± 0.16 a
    3 聚乙烯醇 PVA 87.12 ± 0.96 a 86 ± 3 a 2.26 ± 0.02 a
    4 吐温-80 Tween-80 33.34 ± 1.42 e 95 ± 3 a 1.86 ± 0.23 b
    5 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate (SDS) 60.49 ± 1.29 c 88 ± 2 a 2.10 ± 0.30 a
    6 十二烷基苯磺酸钠 Sodium dodecylbenzene sulfonate 49.29 ± 2.18 d 90 ± 4 a 2.25 ± 0.29 a
    7 T型木质素磺酸钠 T type sodium lignosulfonate 75.62 ± 1.33 b 91 ± 2 a 2.15 ± 0.09 a
    8 烷基萘磺酸缩聚物钠盐 D425 88.91 ± 0.90 a 80 ± 3 a 0.9 ± 0.46 c
    9 对照组 CK 45.55 ± 2.86 d 160 ± 3 c 2.23 ± 0.33 a
    注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
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    表 3  助剂添加比例对Txc2-1制剂悬浮率和润湿时间的影响

    Table 3.  Effect of different adjuvants on the suspension rate and wetting time of Txc2-1 WPs

    助剂
    Agents
    添加比例
    Addition proportion/%
    悬浮率
    Suspensibility/%
    润湿时间
    Wetting time/s
    对照组 CK 0 35.71 ± 1.29 f 167 ± 3 e
    T 型木质素磺酸钠
    T type sodium lignosulfonate
    7.5 47.19 ± 1.10 e 114 ± 3 d
    10.0 58.54 ± 1.97 d 107 ± 4 c
    12.5 58.57 ± 0.57 d 96 ± 2 c
    十二烷基硫酸钠
    SDS
    7.5 59.68 ± 1.30 d 89 ± 3 b
    10.0 62.62 ± 1.62 c 85 ± 3 b
    12.5 67.11 ± 0.47 c 64 ± 3 a
    聚乙烯醇 PVA 7.5 76.67 ± 1.22 b 97 ± 4 c
    10 77.23 ± 1.86 b 85 ± 4 b
    12.5 85.80 ± 0.61 a 83 ± 5 b
    注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。
    Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
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    表 4  混料试验设计方案及响应值

    Table 4.  Program and response value of mixture design

    序号
    No.
    十二烷基硫酸钠
    SDS
    聚乙烯醇
    PVA/%
    轻质碳酸钙
    Light calcium carbonate/%
    润湿时间
    Wetting time/s
    pH悬浮率
    Suspensibility/%
    17.19.683.3146 ± 57.98 ± 0.0573.54 ± 1.06
    20.012.587.5289 ± 48.45 ± 0.0379.11 ± 0.88
    30.07.592.5324 ± 98.68 ± 0.0271.91 ± 1.25
    412.57.580.072 ± 37.24 ± 0.0372.60 ± 1.03
    57.512.580.0125 ± 37.51 ± 0.0684.79 ± 1.73
    69.67.183.394 ± 57.96 ± 0.0470.66 ± 2.04
    77.13.389.6139 ± 68.43 ± 0.0266.80 ± 1.02
    83.39.687.1185 ± 58.36 ± 0.0372.84 ± 1.54
    912.50.087.565 ± 28.16 ± 0.0259.61 ± 1.56
    107.50.092.5121 ± 38.54 ± 0.0458.26 ± 1.05
    119.63.387.186 ± 48.44 ± 0.0265.94 ± 1.66
    126.76.786.7183 ± 58.30 ± 0.0167.42 ± 1.72
    133.37.189.6210 ± 18.55 ± 0.0369.42 ± 1.15
    注:表中前3列数值表示各成分在整体中所占的质量分数,3种组分质量分数之和为1。Note: Values in the table indicate the mass fraction of each component, and the sum of the mass fractions of three components is 1.
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    表 5  优化载体配方的试验验证

    Table 5.  Experimental verification of optimized wettable powder formulation

    项目
    Item
    制剂性能指标 Formulation performance
    润湿时间 Wetting time/spH悬浮率 Suspensibility/%
    预测值 Predicted value 109 7.92 72.2
    实测值 Experimental value 104 ± 2 8.06 ± 3.02 74.3 ± 1.5
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    表 6  解淀粉芽孢杆菌Txc2-1 WP对大白菜根肿病的盆栽防效

    Table 6.  Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens Txc2-1 WP for the biological control against Plasmodiophora brassicae in the pot tests

    处理
    Treatment
    第一次调查结果 (播种后30 d)
    Results of the first survey (30 days after sowing)
    第二次调查结果 (播种后60 d)
    Results of the Second survey (60 days after sowing)
    平均病情指数
    Average disease index
    平均防效
    Average efficacy/%
    平均病情指数
    Average disease index
    平均防效
    Average efficacy/%
    A1 13.9 70.2 ± 3.3 bB 13.6 66.8 ± 3.1 bB
    A2 14.2 68.8 ± 1.4 bB 14.1 65.6 ± 2.1 bB
    A3 17.3 59.8 ± 3.8 cC 17.5 57.3 ± 4.0 cC
    A4 20.0 53.3 ± 3.8 dD 19.9 51.4 ± 3.8 dD
    B 11.2 68.5 ± 1.9 bB 14.2 65.4 ± 0.5 bB
    C 11.7 76.3 ± 1.2 aA 11.3 72.5 ± 1.0 aA
    CK 15.1 41.0
    注:表中A1、A2、A3、A4分别代Txc2-1 WP (30亿CFU/g) 稀释300倍、300倍 (第3次不施药)、600倍、900倍;B代表阳性对照枯草芽孢杆菌WP (100亿CFU/g) 稀释300倍;C代表阳性对照氟啶胺 (500 g/L);CK代表清水空白对照;同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P<0.05),同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。Note: In this table, A1, A2, A3 and A4 are the Txc2-1 WP (30 billion CFU/g) diluted by 300 times, 300 times without third pesticide application, 600 times and 900 times, respectively; B is the Bacillus subtilis WP (10 billion CFU/g) diluted 300 times as positive control; C is fluazinam (500 g/L) as positive control; CK is clear water as the blank control; Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.05), Different uppercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.01).
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    表 7  解淀粉芽孢杆菌Txc2-1 WP对大白菜根肿病的田间防效

    Table 7.  Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens Txc2-1 WP for the biological control against Plasmodiophora brassicae in the field experiments

    处理
    Treatment
    第一次调查结果 (播种后30 d)
    Results of the first survey (30 days after sowing)
    第二次调查结果 (播种后60 d)
    Results of the Second survey (60 days after sowing)
    平均病情指数
    Average disease index
    平均防效
    Average efficacy/%
    平均病情指数
    Average disease index
    平均防效
    Average efficacy/%
    A1 13.9 70.2 ± 3.3 bB 13.6 66.8 ± 3.1 bB
    A2 14.2 68.8 ± 1.4 bB 14.1 65.6 ± 2.1 bB
    A3 17.3 59.8 ± 3.8 cC 17.5 57.3 ± 4.0 cC
    A4 20.0 53.3 ± 3.8 dD 19.9 51.4 ± 3.8 dD
    B 11.2 68.5 ± 1.9 bB 14.2 65.4 ± 0.5 bB
    C 11.7 76.3 ± 1.2 aA 11.3 72.5 ± 1.0 aA
    CK 15.1 41.0
    注:表中A1、A2、A3、A4分别代Txc2-1 WP (30亿CFU/g) 稀释300倍、300倍 (第3次不施药)、600倍、900倍;B代表阳性对照枯草芽孢杆菌WP(100亿CFU/g) 稀释300倍;C代表阳性对照氟啶胺 (500 g/L);CK代表清水空白对照;同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05),同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。Note: In this table, A1, A2, A3 and A4 are the Txc2-1 WP (30 billion CFU/g) diluted by 300 times, 300 times without third pesticide application, 600 times and 900 times, respectively; B is the Bacillus subtilis WP (10 billion CFU/g) diluted 300 times as positive control; C is fluazinam (500 g/L) as positive control; CK is clear water as the blank control; Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.05), Different uppercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.01).
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-05-13
  • 网络出版日期:  2019-08-29
  • 刊出日期:  2020-02-01

防治白菜根肿病的新型海洋微生物农药——解淀粉芽孢杆菌Txc2-1可湿性粉剂配方优化及药效研究

    通讯作者: 李元广, ygli@ecust.edu.cn
    作者简介: 张致军,男,硕士研究生,E-mail:997624237@qq.com
  • 1. 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237
  • 2. 上海泽元海洋生物技术有限公司,上海 200237
  • 3. 云南省农业科学院 农业环境资源研究所,昆明 650000

DOI: 10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0082

摘要: 根肿病是十字花科作物的全球性重大病害之一,但可供选择的防治药剂非常有限。以本课题组筛选出的一株对十字花科白菜根肿病具有显著拮抗作用的海洋生境芽孢杆菌Txc2-1为研究对象,通过对载体和助剂的筛选以及采用混料设计确定Txc2-1可湿性粉剂最优配方,同时运用制备的30亿CFU/g可湿性粉剂进行盆栽试验和田间药效的考察。结果表明:Txc2-1可湿性粉剂最佳载体为轻质碳酸钙,最佳润湿剂为十二烷基硫酸钠,最佳悬浮剂为聚乙烯醇 (PVA),这3种物质与Txc2-1菌株有较高的生物相容性,且具有良好的理化性能。通过混料设计确定其最优配比为m (轻质碳酸钙):m (十二烷基硫酸钠):m (PVA) = 83 : 9 : 8。利用5 L罐培养液及上述配方进行喷雾干燥获得了30亿CFU/g Txc2-1可湿性粉剂 (Txc2-1 WP);进一步盆栽 (40 d) 和田间 (60 d) 药效试验结果表明,Txc2-1 WP对白菜根肿病的防效分别达70.53%和66.84%。该解淀粉芽孢杆菌Txc2-1可湿性粉剂达到了国家质量标准,对白菜根肿病具有良好的防治效果,本研究结果为将Txc2-1开发成首个防治根肿病的海洋微生物杀菌剂奠定了基础。

English Abstract

  • 由芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae Woron引起的十字花科作物根肿病是一种世界性的难题[1],目前在中国对于该病害的防治仍以化学防治为主,但可供选择的有效药剂有限,常用的主要有百菌清、氟啶胺、氰霜唑和多菌灵等[2],但频繁施药易造成菌株抗药性、药剂残留及污染水土等问题。微生物农药在土传病害防治上具有显著优势,且对环境和人畜友好,尤其是以海洋微生物为有效成分的微生物农药[3-4],因生境特殊,能比陆地微生物耐受较高的渗透压,特别是对盐渍化土壤中的植物土传病害往往有更好的防效[5],也常产生与陆生微生物不同的具有新结构和新功能的代谢产物[6],使其对难以防治病害具有较好的防治潜力。迄今为止,中国登记的惟一一个防治该病的陆生微生物源农药为100亿个/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂[7],尚未见利用海洋微生物登记药剂防治植物根肿病的报道。

    微生物农药的剂型主要为可湿性粉剂,其有效成分在加工过程中易失活,在润湿性、悬浮率等理化性质上达到国家标准的难度大于化学农药。混料设计可以通过少量试验即得到试验指标与各组分比例的关系式,能够更精确地分析和预测混合效果,科学地指导微生物农药剂型的优化[8]。刘振华等[8]、刘盼西等[9]曾使用混料设计分别对多粘类芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的配方进行优化。

    笔者所在研究团队从中国烟台滨海潮间带的莎草中分离到一株解淀粉芽孢杆菌Txc2-1,前期试验表明其具有广谱的抑菌活性,尤其对十字花科根肿病有很好的生防效果,且具有较高的耐盐能力,能够在高盐渍化土壤中定殖[10]。本文拟对其可湿性粉剂配方中的载体与助剂进行筛选,应用混料设计优化其配比,并制备其可湿性粉剂,进一步测试所制备的可湿性粉剂对十字花科根肿病的盆栽和田间防治效果。

    • 抗十字花科根肿病菌株Txc2-1 (CGMCC No.10916),分离自中国烟台滨海潮间带的莎草中,由本实验室保藏。

    • 轻质碳酸钙 (light calcium carbonate, LCA, 粒径10 μm,1 250目)、高岭土 (粒径10 μm) 和硅藻土 (粒径10 μm),上海缘钛化工产品有限公司;羟基纤维素 (粒径10 μm),山东创耀生物科技有限公司;PEG8000和PEG6000,济宁百川化工有限公司;聚乙烯醇 (PVA),上海凯杜实业发展有限公司;吐温–80,无锡市亚泰联合化工有限公司;十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS),上虞浙创化工有限公司;T型木质素磺酸钠,Akzonobel化学品 (宁波) 有限公司;烷基萘磺酸缩聚物钠盐 (D425),新沂市飞皇化工有限公司。

    • SD-001小型喷雾干燥塔,无锡禾明干燥设备有限公司;FS-100粉碎机,鹤壁市英泰电子电器有限公司。

    • 按照国家相关标准分别测定Txc2-1可湿性粉剂 (以下简称Txc2-1 WP) 的细度 (GB/T 16150—2000)[11]、悬浮率 (GB/T 14825—1993)[12]、pH值 (GB/T 1601—1993)[13]、润湿时间 (GB/T 5451—2001)[14],采用平板计数法[15]测定活菌量。

    • 将Txc2-1发酵液分别与轻质碳酸钙、高岭土、羟基纤维素、硅藻土按照一定比例混合,经小型喷雾干燥塔干燥,分别收集各原粉,测定细度、悬浮率、润湿时间、pH和活菌量。

    • 将1.3节制备的原粉分别与助剂PEG8000、PEG6000、聚乙烯醇、吐温-80、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、T型木质素磺酸钠、烷基萘磺酸缩聚物钠盐按照厂商推荐比例混合均匀后经粉碎机粉碎,制得小试样品,测定其悬浮率、润湿时间和活菌量。

    • 将助剂分别按照质量分数5%、7.5%和12.5%的比例与原粉混合,经粉碎机粉碎后测定悬浮率、润湿时间和活菌量。助剂单因素试验之后,采用极端顶点设计法[16]进行混料设计优化,设定载体、悬浮剂和润湿剂3者的质量分数之和为1,其中助剂的质量分数上限由助剂单因素试验结果决定,分别测定所得制剂的润湿时间、pH值和悬浮率等理化性能。采用Minitab 16软件对试验数据进行分析,得出最优的载体、悬浮剂与润湿剂配比,并利用5 L罐培养液与获得的配方在喷雾干燥塔中进行试验、生产与验证,制得30亿CFU/g Txc2-1 WP。

    • 盆栽与田间试验于2017年7月在云南省昆明市 (E102.43°,N25.02°) 由云南省农业科学院农业环境资源研究所协助开展。田间试验按照中国农业部制定的田间药效准则 (GB/T 17980.30—2000)[17]进行,所有试验小区的栽培条件 (土壤、肥料、播栽期、生育阶段及株行距) 保持一致。

      将30亿CFU/g Txc2-1 WP分别稀释300、600和900倍,得到3个供试样品 (详见1.5节中5 L发酵罐-喷雾干燥塔制备),以化学农药氟啶胺 (500 g/L) 和陆地微生物农药100亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂为阳性对照,以清水为空白对照,使用剂量为750 L/hm2。采用随机区组设计,每处理设置4个重复,每重复1个小区,每小区面积为20 m2

      盆栽试验于播种当天和播种后7 d用药,分别于播种后20和40 d调查发病情况;田间试验于播种当天和播种后10 d用药,分别于播种后30和60 d调查发病情况。

      根肿病病级共分5级:0级-无病;1级-病瘤只出现在侧根,且只占根系1%~25%;2级-病瘤在主根和侧根出现,且占根系26%~50%;3级-主根有大量根瘤出现,根瘤占根系的51%~75%;4级-主根有大量根瘤出现,根瘤占根系的75%以上。病情指数 (D) 按公式 (1) 计算,防治效果 (P,%) 按公式 (2) 计算。

      $ D = \sum \left({{N_i} \times i} \right)/{N_{\rm{d}}} \times {\rm{ }}4 $

      (1)

      其中:Ni是病级数,i是该病级所有的病株数,Nd是所有测试植物株数。

      $ P = \left({{D_{{\rm{(CKi)}}}} - {D_{{\rm{(PTi)}}}}} \right)/{D_{{\rm{(CKi)}}}} \times {\rm{ }}100\% {\rm{ }}\left({i = {\rm{ }}0,\;1,\;2,\;3\;{\rm{or}}\;4} \right) $

      (2)

      其中:D(CKi)为空白对照组的病情指数;D(PTi)为处理组的病情指数。

    • 考察不同载体对制剂理化性能的影响,结果见表1。当使用轻质碳酸钙和羟基纤维素为载体时,所得制剂的悬浮率和润湿性性能较优,但羟基纤维素的成本高于其他载体10倍左右,且细度 (通过44 μm试验筛) 低于95%,所以选择轻质碳酸钙作为Txc2-1制剂的载体。

      表 1  载体对Txc2-1制剂理化性能的影响

      Table 1.  Effect of carriers on physicochemical properties of Txc2-1 WPs

      序号
      No.
      载体
      Carrier
      细度
      Fineness (≤ 44 μm)/%
      悬浮率
      Suspensibility/%
      润湿时间
      Wetting time/s
      活菌量
      Vable count/(109 CFU/g)
      1轻质碳酸钙
      Light calcium carbonate
      98.1 ± 0.1 a52.95 ± 2.43 a195 ± 4 b2.39 ± 0.29 a
      2高岭土
      White clay
      98.2 ± 0.3 a40.35 ± 1.13 c237 ± 9 c2.42 ± 0.24 a
      3羟基纤维素
      Hydroxycellulose
      90.2 ± 0.1 b56.82 ± 2.18 a160 ± 3 a2.62 ± 0.28 a
      4硅藻土
      Diatomaceous earth
      98.4 ± 0.2 a47.39 ± 0.77 b215 ± 8 c2.58 ± 0.11 a
      注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
    • 表2数据可以看出:当以PVA和D425为助剂时,Txc2-1制剂悬浮率均大于80%,但以D425为助剂时,制剂活菌量只有0.9 × 109 CFU/g,说明D425与Txc2-1的生物相容性较差,不适合作助剂,而PVA与Txc2-1的生物相容性较好;此外,当使用十二烷基硫酸钠和T型木质素磺酸钠为助剂时,制剂的润湿时间相对较短,所以选择PVA、十二烷基硫酸钠和T型木质素磺酸钠这3种助剂进一步考察。

      表 2  助剂对Txc2-1制剂理化性能的影响

      Table 2.  Effects of additives on physicochemical properties of Txc2-1 WPs

      序号
      No.
      助剂
      Agent
      悬浮率
      Suspensibility/%
      润湿时间
      Wetting time/s
      活菌量
      Vable count/(109 CFU/g)
      1 PEG8000 50.42 ± 0.63 d 108 ± 3 b 2.29 ± 0.04 a
      2 PEG6000 51.61 ± 1.13 d 108 ± 4 b 2.30 ± 0.16 a
      3 聚乙烯醇 PVA 87.12 ± 0.96 a 86 ± 3 a 2.26 ± 0.02 a
      4 吐温-80 Tween-80 33.34 ± 1.42 e 95 ± 3 a 1.86 ± 0.23 b
      5 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate (SDS) 60.49 ± 1.29 c 88 ± 2 a 2.10 ± 0.30 a
      6 十二烷基苯磺酸钠 Sodium dodecylbenzene sulfonate 49.29 ± 2.18 d 90 ± 4 a 2.25 ± 0.29 a
      7 T型木质素磺酸钠 T type sodium lignosulfonate 75.62 ± 1.33 b 91 ± 2 a 2.15 ± 0.09 a
      8 烷基萘磺酸缩聚物钠盐 D425 88.91 ± 0.90 a 80 ± 3 a 0.9 ± 0.46 c
      9 对照组 CK 45.55 ± 2.86 d 160 ± 3 c 2.23 ± 0.33 a
      注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
    • 以PVA、十二烷基硫酸钠和T型木质素磺酸钠为助剂进一步考察结果见表3。当以十二烷基硫酸钠为助剂时,随着添加比例的增加,Txc2-1制剂的润湿时间迅速降低;当以PVA为助剂时,制剂的悬浮率均高于75%。因此,后续试验使用载体轻质碳酸钙和助剂十二烷基硫酸钠、PVA进行混料设计,以确定制剂配方的最佳配比。

      表 3  助剂添加比例对Txc2-1制剂悬浮率和润湿时间的影响

      Table 3.  Effect of different adjuvants on the suspension rate and wetting time of Txc2-1 WPs

      助剂
      Agents
      添加比例
      Addition proportion/%
      悬浮率
      Suspensibility/%
      润湿时间
      Wetting time/s
      对照组 CK 0 35.71 ± 1.29 f 167 ± 3 e
      T 型木质素磺酸钠
      T type sodium lignosulfonate
      7.5 47.19 ± 1.10 e 114 ± 3 d
      10.0 58.54 ± 1.97 d 107 ± 4 c
      12.5 58.57 ± 0.57 d 96 ± 2 c
      十二烷基硫酸钠
      SDS
      7.5 59.68 ± 1.30 d 89 ± 3 b
      10.0 62.62 ± 1.62 c 85 ± 3 b
      12.5 67.11 ± 0.47 c 64 ± 3 a
      聚乙烯醇 PVA 7.5 76.67 ± 1.22 b 97 ± 4 c
      10 77.23 ± 1.86 b 85 ± 4 b
      12.5 85.80 ± 0.61 a 83 ± 5 b
      注:同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。
      Note: Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P < 0.05).
    • 根据Minitab软件的极端顶点设计方法,选择载体轻质碳酸钙、助剂十二烷基硫酸钠和PVA进行了混料设计,其试验次数及对应比例见图1 (图中的13个点),具体方案及所得各可湿性粉剂的润湿时间、pH值和悬浮率测定结果见表4

      图 1  极端顶点设计

      Figure 1.  Extreme vertex design

      表 4  混料试验设计方案及响应值

      Table 4.  Program and response value of mixture design

      序号
      No.
      十二烷基硫酸钠
      SDS
      聚乙烯醇
      PVA/%
      轻质碳酸钙
      Light calcium carbonate/%
      润湿时间
      Wetting time/s
      pH悬浮率
      Suspensibility/%
      17.19.683.3146 ± 57.98 ± 0.0573.54 ± 1.06
      20.012.587.5289 ± 48.45 ± 0.0379.11 ± 0.88
      30.07.592.5324 ± 98.68 ± 0.0271.91 ± 1.25
      412.57.580.072 ± 37.24 ± 0.0372.60 ± 1.03
      57.512.580.0125 ± 37.51 ± 0.0684.79 ± 1.73
      69.67.183.394 ± 57.96 ± 0.0470.66 ± 2.04
      77.13.389.6139 ± 68.43 ± 0.0266.80 ± 1.02
      83.39.687.1185 ± 58.36 ± 0.0372.84 ± 1.54
      912.50.087.565 ± 28.16 ± 0.0259.61 ± 1.56
      107.50.092.5121 ± 38.54 ± 0.0458.26 ± 1.05
      119.63.387.186 ± 48.44 ± 0.0265.94 ± 1.66
      126.76.786.7183 ± 58.30 ± 0.0167.42 ± 1.72
      133.37.189.6210 ± 18.55 ± 0.0369.42 ± 1.15
      注:表中前3列数值表示各成分在整体中所占的质量分数,3种组分质量分数之和为1。Note: Values in the table indicate the mass fraction of each component, and the sum of the mass fractions of three components is 1.
    • 各组分影响润湿时间的等值线分析结果见图2。其中,助剂十二烷基硫酸钠含量的增加会明显缩短制剂的润湿时间,而助剂PVA含量的增加则会相对延长制剂的润湿时间,当十二烷基硫酸钠的比例高于4%时可基本控制制剂的润湿时间在180 s以内。对试验数据进行回归,得到润湿时间与3种组分含量的经验方程 (3):

      图 2  润湿时间与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线图

      Figure 2.  Contour map of wetting time affected by SDS and PVA

      $ \begin{split} {y_1} = &7\;528{\omega _a} - 1\;995{\omega _b} + 332{\omega _c} - 4\;347{\omega _{ab}} - \\ &10\;738{\omega _{ac}}+ 2261{\omega _{bc}} \end{split}\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\! $

      (3)

      式中ωaωbωc分别代表配方中的载体轻质碳酸钙、助剂十二烷基硫酸钠和PVA在制剂中的质量分数,y1为制剂润湿时间 (s),R2 = 0.9 651。

    • 各组分对pH影响的等值线分析结果见图3。随着助剂十二烷基硫酸钠和PVA的含量增加 (即载体轻质碳酸钙的含量相对减少),制剂的pH值明显下降,这可能是因为虽然轻质碳酸钙的pH值较低,但制剂的pH值主要受载体理化性能的影响,随着载体轻质碳酸钙的含量相对减少,制剂的pH值有所降低。3种成分质量分数与制剂pH值间的关系可用方程 (4) 表示。

      图 3  pH与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线

      Figure 3.  Contour map of pH affected by SDS and PVA

      $ \begin{split} \!\!\!\!\!\!{y_2} =& \!-\! 69.72{\omega _a} \!-\! 51.19{\omega _b}\! +\! 8.26{\omega _c} \!+\! 23.11{\omega _{ab}}\;+\! \\ &88.50{\omega _{ac}}+ 69.71{\omega _{bc}} \end{split}\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\! $

      (4)

      式中,ωaωbωc分别为载体轻质碳酸钙、助剂十二烷基硫酸钠和PVA在制剂中的质量分数,y2为制剂pH值,R2 = 0.979 4。

    • 助剂PVA含量对制剂悬浮率的影响最大,当十二烷基硫酸钠质量分数相同时,PVA的质量分数增加有利于制剂悬浮率的升高 (图4)。当PVA质量分数为7%以上时,制剂的悬浮率可达到70%以上区域四)。3种成分质量分数与制剂悬浮率间的关系可用方程5) 表示。

      图 4  悬浮率与十二烷基硫酸钠、PVA的等值线图

      Figure 4.  Contour map of suspensibility affected by SDS and PVA

      $ \begin{split} {y_3} =& 359.1{\omega _a} + 893.7{\omega _b} + 65.0{\omega _c} - 302.4{\omega _{ab}} - \\ &385.6{\omega _{ac}}- 817.6{\omega _{bc}} \end{split}\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\!\! $

      (5)

      式中,ωaωbωc分别为载体轻质碳酸钙、助剂十二烷基硫酸钠和PVA在制剂中的质量分数,y3为制剂悬浮率 (%),R2 = 0.954 7。

    • 根据中国农药可湿性粉剂质量要求,设定解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间、悬浮率和pH的期望值范围分别为60~120 s、70%~80%和7.0~8.0,本文通过Minitab软件优化得到了1个最优的载体组成配方范围 (图5中优化区域):轻质碳酸钙质量分数为80%~82% (即含量比值为0.80~0.82),十二烷基硫酸钠质量分数为8.0%~13.3% (即含量比值为0.08~0.133),PVA质量分数为6.5%~1.0% (即含量比值为0.065~0.1),此时制剂润湿时间在68~119 s之间,pH值在7.3~8.0之间,悬浮率在70.6%~79.38%之间。由此可见,十二烷基硫酸钠对降低制剂润湿时间有极大贡献,PVA可有效提高制剂的悬浮率,而制剂的pH值主要由载体轻质碳酸钙本身的理化性能决定。

      图 5  解淀粉芽孢杆菌制剂多指标配方优化区域

      Figure 5.  Optimization area of multi-index formula for the preparation of B. amyloliquefaciens

      图5的优化区域内任取1个点作为验证的载体配方。该配方组成 (质量分数) 为:轻质碳酸钙83.0%,十二烷基硫酸钠9.0%和PVA 8.0%。基于这一配比进行5 L发酵罐生产与喷雾干燥塔试验,所得制剂的实测值与各项性能指标的预测值比较接近 (表5),表明图5所预测的优化区域内的载体配方是可行的。因此,将该配方确定为解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的配方。

      表 5  优化载体配方的试验验证

      Table 5.  Experimental verification of optimized wettable powder formulation

      项目
      Item
      制剂性能指标 Formulation performance
      润湿时间 Wetting time/spH悬浮率 Suspensibility/%
      预测值 Predicted value 109 7.92 72.2
      实测值 Experimental value 104 ± 2 8.06 ± 3.02 74.3 ± 1.5
    • 表6数据可知:Txc2-1 WP稀释300倍液,在播种后20 d和40 d的防效与对照微生物农药枯草芽孢杆菌WP (100亿CFU/g) 稀释300倍液的防效相似,但低于对照化学农药氟啶胺 (500 g/L),播种20 d,防效相差约10%,而播种后40 d,防效相差约4%,说明生物农药的防效从长期来说比较稳定。

      表 6  解淀粉芽孢杆菌Txc2-1 WP对大白菜根肿病的盆栽防效

      Table 6.  Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens Txc2-1 WP for the biological control against Plasmodiophora brassicae in the pot tests

      处理
      Treatment
      第一次调查结果 (播种后30 d)
      Results of the first survey (30 days after sowing)
      第二次调查结果 (播种后60 d)
      Results of the Second survey (60 days after sowing)
      平均病情指数
      Average disease index
      平均防效
      Average efficacy/%
      平均病情指数
      Average disease index
      平均防效
      Average efficacy/%
      A1 13.9 70.2 ± 3.3 bB 13.6 66.8 ± 3.1 bB
      A2 14.2 68.8 ± 1.4 bB 14.1 65.6 ± 2.1 bB
      A3 17.3 59.8 ± 3.8 cC 17.5 57.3 ± 4.0 cC
      A4 20.0 53.3 ± 3.8 dD 19.9 51.4 ± 3.8 dD
      B 11.2 68.5 ± 1.9 bB 14.2 65.4 ± 0.5 bB
      C 11.7 76.3 ± 1.2 aA 11.3 72.5 ± 1.0 aA
      CK 15.1 41.0
      注:表中A1、A2、A3、A4分别代Txc2-1 WP (30亿CFU/g) 稀释300倍、300倍 (第3次不施药)、600倍、900倍;B代表阳性对照枯草芽孢杆菌WP (100亿CFU/g) 稀释300倍;C代表阳性对照氟啶胺 (500 g/L);CK代表清水空白对照;同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P<0.05),同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。Note: In this table, A1, A2, A3 and A4 are the Txc2-1 WP (30 billion CFU/g) diluted by 300 times, 300 times without third pesticide application, 600 times and 900 times, respectively; B is the Bacillus subtilis WP (10 billion CFU/g) diluted 300 times as positive control; C is fluazinam (500 g/L) as positive control; CK is clear water as the blank control; Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.05), Different uppercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.01).
    • 表7可知,播种后30 d和播种后60 d两次调查Txc2-1 WP与枯草芽孢杆菌WP在同等稀释倍数下效果相当。而枯草芽孢杆菌WP (100亿CFU/g) 活菌含量明显比解淀粉芽孢杆菌Txc2-1 WP (30亿CFU/g) 高,所以提高Txc2-1 WP中的活菌含量后,预测效果应该比枯草芽孢杆菌WP效果更好。两次调查结果显示,微生物农药的防效略逊色于化学农药。

      表 7  解淀粉芽孢杆菌Txc2-1 WP对大白菜根肿病的田间防效

      Table 7.  Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens Txc2-1 WP for the biological control against Plasmodiophora brassicae in the field experiments

      处理
      Treatment
      第一次调查结果 (播种后30 d)
      Results of the first survey (30 days after sowing)
      第二次调查结果 (播种后60 d)
      Results of the Second survey (60 days after sowing)
      平均病情指数
      Average disease index
      平均防效
      Average efficacy/%
      平均病情指数
      Average disease index
      平均防效
      Average efficacy/%
      A1 13.9 70.2 ± 3.3 bB 13.6 66.8 ± 3.1 bB
      A2 14.2 68.8 ± 1.4 bB 14.1 65.6 ± 2.1 bB
      A3 17.3 59.8 ± 3.8 cC 17.5 57.3 ± 4.0 cC
      A4 20.0 53.3 ± 3.8 dD 19.9 51.4 ± 3.8 dD
      B 11.2 68.5 ± 1.9 bB 14.2 65.4 ± 0.5 bB
      C 11.7 76.3 ± 1.2 aA 11.3 72.5 ± 1.0 aA
      CK 15.1 41.0
      注:表中A1、A2、A3、A4分别代Txc2-1 WP (30亿CFU/g) 稀释300倍、300倍 (第3次不施药)、600倍、900倍;B代表阳性对照枯草芽孢杆菌WP(100亿CFU/g) 稀释300倍;C代表阳性对照氟啶胺 (500 g/L);CK代表清水空白对照;同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05),同列数据后不同大写字母表示差异极显著 (P<0.01)。Note: In this table, A1, A2, A3 and A4 are the Txc2-1 WP (30 billion CFU/g) diluted by 300 times, 300 times without third pesticide application, 600 times and 900 times, respectively; B is the Bacillus subtilis WP (10 billion CFU/g) diluted 300 times as positive control; C is fluazinam (500 g/L) as positive control; CK is clear water as the blank control; Different lowercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.05), Different uppercase letters behind the corresponding data in the same column mean statistically significant difference (P<0.01).
    • 十字花科作物根肿病是一种世界性的难题,而解淀粉芽孢杆菌对其具有良好的生防潜力[18],因此其农药制剂成品在田间的防治效果亟待试验和证实。本文以对十字花科根肿病具有较好抑制效果的解淀粉芽孢杆菌Txc2-1为研究对象,通过助剂、载体的筛选和混料设计确定了解淀粉芽孢杆菌最佳可湿性粉剂配方,达到了国家标准的要求,并在盆栽试验与田间试验中证实其对白菜根肿病具有良好的防治效果,为海洋微生物杀菌剂在防治根肿病领域的开发奠定了基础。

      剂型是农药有效成分的最终使用形式或状态[19],是农药能极大发挥其药效的保证。微生物农药的药效成分为疏水颗粒,除了加工过程中的生物相容性问题 (失活) 外,在润湿性、pH值及悬浮率等理化性质方面对其剂型的选择与优化提出了更高的要求[20-21]。本文先通过单因素试验,确定Txc2-1 WP制剂最适的载体 (轻质碳酸钙)、悬浮剂 (PVA) 和润湿剂 (十二烷基硫酸钠),之后采用混料设计方法,在确定组分与含量的限制条件下制定多因素多响应值优化方案,通过较少的试验次数,实现多目标同步优化。这一结果在5 L罐培养及喷雾干燥制备的30亿/g Txc2-1 WP生产过程中得到运用,与预期结果相符,证明该方法科学合理,快速有效,同时满足生防菌活菌率与国家标准所要求的理化指标。

      上述30亿/g Txc2-1 WP在稀释300倍后对十字花科白菜根肿病后期的温室和田间防效分别达到70.53%和66.8%,表明Txc2-1 WP在较低活菌含量条件下 (30亿CFU/g) 仍能对白菜根肿病具有良好的防治效果,在相同稀释倍数下,其防效与陆地微生物农药——100亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防效相当;此外,虽然在温室和田间试验中,Txc2-1 WP的防效均略低于化学药剂氟啶胺,但通过提高WP中活菌含量的方法有望提高防治效果[22],获得比化学农药更好的防效 (表6表7的药效也表明这一趋势)。因此解淀粉芽孢杆菌Txc2-1具有开发为首个防治十字花科根肿病的海洋微生物杀菌剂的潜力。

参考文献 (22)

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