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耳叶水苋对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性及其分子机制初探

张建树 刘冰 蔡新忠 周伟军 王会福 陆强 周国军 刘亚光 梁文 王硕 朱金文

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耳叶水苋对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性及其分子机制初探

    作者简介: 张建树,男,硕士研究生,E-mail:315274074@qq.com.
    通讯作者: 刘亚光, liuyaguang929@163.com ; 朱金文, zhjw@zju.edu.cn
  • 中图分类号: S481.4

Resistance and its resistant molecular mechanism ofAmmannia arenaria to ALS inhibiting herbicides

    Corresponding author: Yaguang LIU, liuyaguang929@163.com ;Jinwen ZHU, zhjw@zju.edu.cn
  • CLC number: S481.4

  • 摘要: 近年来长江下游地区稻田耳叶水苋Ammannia arenaria H.B.K. 危害十分严重。采用盆栽法首次测定了耳叶水苋对苄嘧磺隆等药剂的抗性水平,同时分析了其抗性和敏感种群间乙酰乳酸合成酶 (ALS) 基因的DNA序列及其RNA表达差异。结果表明:采自浙江嘉兴 (JX110)、江苏苏州 (JS039)、浙江宁波 (NB0143-05) 和安徽广德 (AH014) 的耳叶水苋生物型对苄嘧磺隆的抗性指数 (RI) 分别为67.90、17.59、44.63和8.37,对苄嘧磺隆表现出中高水平抗性的生物型对五氟磺草胺、双草醚及咪唑乙烟酸也产生了低水平的抗性。获得了耳叶水苋ALS 基因全长核苷酸序列2 235 bp,编码667个氨基酸,仅发现NB0143-05等 3种抗性生物型ALS酶的氨基酸序列非保守区第93位的亮氨酸被脯氨酸取代。然而,NB0143-05 的ALS酶对ALS抑制剂的敏感性大幅度降低 (RI 37.04),且在苄嘧磺隆处理后4 d的ALS基因表达量是敏感生物型 (HZ001) 的1.86倍。这表明,ALS酶对药剂的敏感性降低以及被苄嘧磺隆诱导后ALS基因表达量显著增加,很可能是耳叶水苋生物型NB0143-05对ALS抑制剂产生抗性的原因。
  • 图 1  耳叶水苋ALS基因3′-RACE的扩增结果

    Figure 1.  The amplification of 3′-RACE of A. arenaria ALS gene

    图 2  耳叶水苋ALS基因5′-RACE的扩增结果

    Figure 2.  The amplification of 5′-RACE of A. arenariaALS gene

    图 3  耳叶水苋抗苄嘧磺隆与敏感生物型ALS基因在药剂诱导后表达量比较

    Figure 3.  Comparison of ALS gene expression of the bensulfuron-methyl resistant and susceptible biotype of A. arenaria after induced by BSM

    表 1  耳叶水苋对除草剂的抗性测定药剂处理剂量

    Table 1.  The application dosage of different herbicides in the resistance test of Ammannia arenaria

    除草剂 Herbicides生物型 Biotype处理剂量(有效成分) Application dosage (a.i.)/(g/hm2)
    苄嘧磺隆 bensulfuron-methylS00.0500.100.200.400.801.63.2
    R00.501.02.04.08.01632
    五氟磺草胺 penoxsulamS00.0120.0250.0500.100.200.400.801.6
    R00.20.40.81.63.26.412.825.6
    双草醚 bispyribac-sodiumS00.0120.0250.0500.100.200.400.801.6
    R00.200.400.801.63.26.412.825.6
    咪唑乙烟酸 imazethapyS00.0500.100.200.400.801.63.26.4
    R00.801.63.26.412.825.651.2102.4
    注:S-敏感生物型;R-抗性生物型。Note: S-Sensitive biotype; R-Resistant biotype.
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    表 2  PCR扩增耳叶水苋ALS基因片段的引物序列

    Table 2.  Primers for PCR amplification of ALS gene from A. arenaria

    引物
    Primer
    序列
    Sequence (5′—3′)
    退火温度
    Annealing temperature/℃
    ALS-F1 TCTCGTHAGYGGNCTTGC 50.0
    ALS-F2 GGHCAAGTYCCYCGKMGRATGAT 50.0
    ALS-R1 TCYTCCCAYTGMACAACCAT 50.0
    ALS-R2 GCAGCAGGCAGTCCAAAMCCCAT 50.0
    5′ GSP1 CGGTGGCTTGGGCAACCTGGAYAT 71.8
    3′ GSP2 GAGGCCAAAGTGTCGGAGCAGAKGT 70.9
    5′ NGSP1 CCTCGCTCACCACCCTCGGAATA 69.2
    3′ NGSP2 CGGGCAGCATCAAATGTGGGC 70.0
    注:Y=C或T;H=A,T或C;M=A或C;N=A,T,G或C;R=A或G;K=T或G。Notes:Y=C or T;H=A, T or C;M=A or C;N=A, T, G or C;R=A or G;K=T or G.
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    表 3  实时定量PCR的引物序列

    Table 3.  The sequences of primers for Real Time Quantitative PCR

    基因
    Gene
    引物
    Primer
    序列
    Sequence (5′—3′)
    Tm
    Tm value
    扩增长度
    Amplification size/bp
    β-actinAction-F-2TGGCATCACACTTTCTACAA54220
    Action-R-2ACACCATCACCAGAATCG56
    ALSALS-FGGACACTGACATGGACT59220
    ALS-RCGCTACGTAACGGCATGACAGTG57
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    表 4  不同耳叶水苋生物型对4种ALS抑制剂的抗性水平

    Table 4.  Resistance level of different A. arenaria biotypes to four ALS inhibiting herbicides

    药剂
    Herbicide
    生物型
    Biotype
    鲜重抑制中剂量
    ED50/(g/hm2)
    抗性指数
    Resistance index
    苄嘧磺隆
    bensulfuron-methy
    HZ0010.180 ± 0.1401.00
    JS0393.16 ± 0.5417.6
    JX11012.2 ± 1.867.9
    NB0143-058.02 ± 0.9844.6
    AH0141.50 ± 0.298.37
    五氟磺草胺
    penoxsulam
    HZ0010.160 ± 0.2101.00
    JS0390.590 ± 0.0503.73
    JX1100.780 ± 0.1704.96
    NB0143-050.850 ± 0.1005.43
    AH0140.710 ± 0.2104.55
    双草醚
    bispyribac-sodium
    HZ0010.190 ± 0.0301.00
    JS0390.400 ± 0.1302.17
    JX1100.930 ± 0.1605.05
    NB0143-050.850 ± 0.3004.60
    AH0140.670 ± 0.1503.64
    咪唑乙烟酸
    imazethapyr
    HZ0010.250 ± 0.0601.00
    JS0391.03 ± 0.314.16
    JX1100.640 ± 0.1502.60
    NB01431.60 ± 0.126.45
    AH0140.490 ± 0.0801.96
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    表 5  耳叶水苋抗苄嘧磺隆与敏感生物型 ALS 氨基酸序列比较

    Table 5.  Comparison of ALS amino acid sequences between the bensulfuron-methyl resistant and susceptible biotypes of A. arenaria

    生物型
    Biotype
    以拟南芥为参考的氨基酸位点
    Amino acid position relative to Arabidopsis thaliana
    899398
    HZ001 TCC CGG TTC GGC CTC GAT GAG CCC CGC AAA
    S R F G L D E P R K
    JS039 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
    S R F G P D E P R K
    JX110 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
    S R F G P D E P R K
    NB0143-05 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
    S R F G P D E P R K
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    表 6  耳叶水苋离体ALS酶对苄嘧磺隆的敏感性

    Table 6.  Susceptibility of ALS enzyme from A. arenaria to bensulfuron-methyl in vitro

    生物型
    Biotype
    回归方程
    Regression equation
    相关系数
    r
    I50 (95%置信限)
    I50 (95% Confidence interval)/(µmol/L)
    HZ001 y = 0.565 9x + 6.755 0 0.999 6 1.92×10−3(8.28×10−4~3.70×10−3)
    NB0143-05 y = 0.332 7x + 5.510 3 0.993 0 0.071 (0.032~0.18)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-12
  • 网络出版日期:  2019-09-29
  • 刊出日期:  2020-02-01

耳叶水苋对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性及其分子机制初探

    通讯作者: 刘亚光, liuyaguang929@163.com
    通讯作者: 朱金文, zhjw@zju.edu.cn
    作者简介: 张建树,男,硕士研究生,E-mail:315274074@qq.com
  • 1. 东北农业大学 农学院,哈尔滨 150030
  • 2. 农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室,浙江大学 农业与生物技术学院,杭州 310058
  • 3. 台州市农业科学研究院,浙江 台州 318000
  • 4. 嘉兴市农业科学研究院,浙江 嘉兴 314016
  • 5. 绍兴市农业科学研究院,浙江 绍兴 312003

DOI: 10.16801/j.issn.1008-7303.2020.0009

摘要: 近年来长江下游地区稻田耳叶水苋Ammannia arenaria H.B.K. 危害十分严重。采用盆栽法首次测定了耳叶水苋对苄嘧磺隆等药剂的抗性水平,同时分析了其抗性和敏感种群间乙酰乳酸合成酶 (ALS) 基因的DNA序列及其RNA表达差异。结果表明:采自浙江嘉兴 (JX110)、江苏苏州 (JS039)、浙江宁波 (NB0143-05) 和安徽广德 (AH014) 的耳叶水苋生物型对苄嘧磺隆的抗性指数 (RI) 分别为67.90、17.59、44.63和8.37,对苄嘧磺隆表现出中高水平抗性的生物型对五氟磺草胺、双草醚及咪唑乙烟酸也产生了低水平的抗性。获得了耳叶水苋ALS 基因全长核苷酸序列2 235 bp,编码667个氨基酸,仅发现NB0143-05等 3种抗性生物型ALS酶的氨基酸序列非保守区第93位的亮氨酸被脯氨酸取代。然而,NB0143-05 的ALS酶对ALS抑制剂的敏感性大幅度降低 (RI 37.04),且在苄嘧磺隆处理后4 d的ALS基因表达量是敏感生物型 (HZ001) 的1.86倍。这表明,ALS酶对药剂的敏感性降低以及被苄嘧磺隆诱导后ALS基因表达量显著增加,很可能是耳叶水苋生物型NB0143-05对ALS抑制剂产生抗性的原因。

English Abstract

  • 耳叶水苋Ammannia arenaria是千屈菜科水苋菜属一年生杂草,原为稻田一般性杂草,近几年发生面积呈急剧扩大趋势,在长三角地区危害尤为严重[1]。该杂草发生周期长,有2个明显的发生高峰[2],田间密度可达463株/m2,导致水稻有效穗数大幅减少,对水稻生产构成了严重威胁[3]

    乙酰乳酸合成酶 (ALS) 是植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸3种支链氨基酸生物合成的关键酶[4],也是磺酰脲类、嘧啶硫代苯甲酸酯类、咪唑啉酮类、磺酰胺羰基三唑啉酮类以及三唑并嘧啶磺酰胺类5类结构不同除草剂的靶标酶[5]。苄嘧磺隆等ALS抑制剂是多年来防除水稻田耳叶水苋等阔叶杂草的主要药剂,然而这类药剂的抗性发展较快。氯磺隆在美国取得登记4年后就在爱达荷州发现了对其产生抗性的野莴苣Lactuca serriola[6];1987年,在堪萨斯州也发现了抗性的地肤Kochia scoparia[7]。近20多年来,全球抗ALS抑制剂的杂草持续增多,至今在30多个国家和地区共有159种杂草生物型产生了抗性,涉及十字花科、禾本科、菊科、雨久花科、泽泻科、蓼科、莎草科、苋科、千屈菜科、旋花科和石竹科等,约占23类除草剂的抗性杂草总数的三分之一[8]。在浙江宁绍平原和杭嘉湖平原稻区,耳叶水苋对苄嘧磺隆已普遍出现抗性,抗性高达124.4倍[9],对于该草的治理是生产上的一个难题。

    杂草的抗药性机制总体上分为2类:靶标抗性和非靶标抗性。其中,靶标抗性主要是由于杂草体内靶标酶基因发生突变,导致靶标酶对药剂的敏感度下降,或者靶标酶的过量表达[10];非靶标抗性主要是由于杂草对除草剂的代谢解毒作用增强,或药剂吸收转运变化导致到达作用部位的药量减少[10]。目前己明确ALS基因5个不连续的高度保守区共有8个位点的突变与抗药性有关,参考拟南芥ALS酶氨基酸序列,分别是第122位丙氨酸、197位脯氨酸、205位丙氨酸、376位天冬氨酸、377位精氨酸、574位色氨酸、653位丝氨酸和654位甘氨酸被取代[11],例如长芒苋Amaranthus palmeri对ALS抑制剂的抗性是由于第197位的脯氨酸被亮氨酸取代[12]。然而,ALS基因表达量的差异可能是荠菜Capsella bursa-pastoris对苯磺隆产生抗性的原因之一[13]

    明确杂草的抗性水平和抗性机理对于制定杂草防治策略至关重要,而关于耳叶水苋这方面的研究尚未见报道。本研究测定了耳叶水苋对4种ALS抑制剂的抗性水平,并初步研究了其抗性分子机制。

    • 耳叶水苋Ammannia arenaria H.B.K.,分别在2010年和2011年采于浙江省杭州 (HZ001)、宁波 (NB0143-05)、嘉兴地区 (JX110),江苏省苏州地区 (JS039) 和安徽省广德地区 (AH014) 的水稻田。其中,NB0143-05、JX110、JS039和AH014为抗苄嘧磺隆生物型,HZ001为敏感生物型,采自浙江大学华家池校区农场水沟边,很少接触除草剂。

    • 96%苄嘧磺隆 (bensulfuron-methyl) 原药,江苏省激素研究所有限公司;20%苄嘧磺隆可湿性粉剂,浙江大学农药与环境毒理研究所配制;100 g/L双草醚 (bispyribac-sodium) 悬浮剂,日本组合化学工业株式会社;25 g/L五氟磺草胺 (penoxsulam) 油悬浮剂,美国陶氏益农公司;5%咪唑乙烟酸 (imazethapy) 水剂,德国巴斯夫公司。

    • VS-840K-U型超净工作台 (苏净安泰公司);MDF-U4086S型超低温冰箱 (日本三洋公司);Power pac 300型电泳仪 (美国Bio-Rad公司);YIQI010型恒温水浴锅 (北京五洲东方科技发展有限公司);JS-680B型紫外成像仪 (上海培清科技公司);AL033223型PCR仪 (美国Bio-Rad公司);BSA224S型万分之一电子天平 (德国sartoriuos公司);5430R 型高速低温离心机 (德国eppendorf公司);SMZ1000型显微镜 (日本尼康公司);NanoDrop 2000型分光光度计 (美国Thermo公司);ABI step one 型荧光定量PCR仪 (美国 Life technology 公司)。

    • 试验在智能温室中进行,将m(泥炭土) : m(珍珠岩) : m(蛭石)= 3 : 1 : 1混合均匀,装入直径100 mm 的塑料盆钵中,播种对苄嘧磺隆抗性和敏感的耳叶水苋种子,并在25~35 ℃、自然光照条件下培养。待幼苗长到一对真叶期时进行移栽,每个盆钵定苗10株。待长至3~4对真叶期时采用ASP-1098型自动喷雾装置进行茎叶喷雾处理,喷头型号ST110-01,施药液量350 L/hm2,喷雾压力0.2 MPa。通过预试验设定除草剂处理剂量 (表1)。设清水对照,3次重复,进行2次重复试验。药剂处理后21 d,称量耳叶水苋地上部分鲜重。

      表 1  耳叶水苋对除草剂的抗性测定药剂处理剂量

      Table 1.  The application dosage of different herbicides in the resistance test of Ammannia arenaria

      除草剂 Herbicides生物型 Biotype处理剂量(有效成分) Application dosage (a.i.)/(g/hm2)
      苄嘧磺隆 bensulfuron-methylS00.0500.100.200.400.801.63.2
      R00.501.02.04.08.01632
      五氟磺草胺 penoxsulamS00.0120.0250.0500.100.200.400.801.6
      R00.20.40.81.63.26.412.825.6
      双草醚 bispyribac-sodiumS00.0120.0250.0500.100.200.400.801.6
      R00.200.400.801.63.26.412.825.6
      咪唑乙烟酸 imazethapyS00.0500.100.200.400.801.63.26.4
      R00.801.63.26.412.825.651.2102.4
      注:S-敏感生物型;R-抗性生物型。Note: S-Sensitive biotype; R-Resistant biotype.

      数据采用SAS统计分析软件进行logistic回归分析,求出ED50值。回归方程为:Y = C + (DC)/[1 + (X/E)b]。其中C为下限值,D为上限值,E为ED50值,bX = ED50时曲线的导数。

      抗性指数 (Resistance index,RI) 计算公式:RI = ED50(R)/ED50(S),R表示抗性生物型,S表示敏感生物型。设定低水平抗性:3 < RI ≤ 10;中等水平抗性:10 < RI ≤ 50;高水平抗性:RI > 50[9]

    • 分别选取耳叶水苋抗性生物型NB0143-05、JS039和JX110和敏感生物型HZ001处于4~5对叶期的幼叶,参考LiCl沉淀法[14]提取耳叶水苋总RNA。

    • 将所得的RNA溶液用微量分光光度计测定其在260 nm处的吸光度值,并进行总RNA的电泳检测。检测方法以及cDNA第一链的合成,均参考文献方法[15]进行。

    • 参考拟南芥等12种不同科属植物的ALS基因核苷酸序列,找出高度保守的同源序列,设计合适的引物 (表2)。采用RACE法扩增目的基因cDNA末端,分别设计3′末端和5′末端的扩增引物[15]。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,用北京百泰克生物技术有限公司的多功能DNA回收纯化试剂盒进行PCR产物的凝胶回收。引物的合成以及测序由铂尚生物技术有限公司完成。将有特异性目的条带的阳性PCR产物样品,每个片段送3个阳性克隆到上海铂尚生物技术有限公司测序。测序结果使用DNA Lasergene系列软件比对。

      表 2  PCR扩增耳叶水苋ALS基因片段的引物序列

      Table 2.  Primers for PCR amplification of ALS gene from A. arenaria

      引物
      Primer
      序列
      Sequence (5′—3′)
      退火温度
      Annealing temperature/℃
      ALS-F1 TCTCGTHAGYGGNCTTGC 50.0
      ALS-F2 GGHCAAGTYCCYCGKMGRATGAT 50.0
      ALS-R1 TCYTCCCAYTGMACAACCAT 50.0
      ALS-R2 GCAGCAGGCAGTCCAAAMCCCAT 50.0
      5′ GSP1 CGGTGGCTTGGGCAACCTGGAYAT 71.8
      3′ GSP2 GAGGCCAAAGTGTCGGAGCAGAKGT 70.9
      5′ NGSP1 CCTCGCTCACCACCCTCGGAATA 69.2
      3′ NGSP2 CGGGCAGCATCAAATGTGGGC 70.0
      注:Y=C或T;H=A,T或C;M=A或C;N=A,T,G或C;R=A或G;K=T或G。Notes:Y=C or T;H=A, T or C;M=A or C;N=A, T, G or C;R=A or G;K=T or G.
    • 选耳叶水苋HZ001与NB0143-05 2种生物型,培养至5~7叶期,参考卢宗志等[16]方法进行离体ALS酶活性测定。在酶活性测定反应体系中,苄嘧磺隆系列浓度分别为0、3、30、300、3 000和30 000 nmol/L。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定。采用上述logistic回归分析求出抑制酶活50%的苄嘧磺隆浓度 (I50) 值。

    • 培养耳叶水苋苄嘧磺隆抗性生物型NB0143-05和敏感生物型HZ001的幼苗。苄嘧磺隆原药用少量丙酮溶解后加入吐温-80 (质量分数0.1%),待植株生长至3~4对叶期进行苄嘧磺隆 (有效成分 0.1 g/hm2) 茎叶喷雾处理,对照组喷施质量分数0.1%的吐温-80与0.9% 丙酮的混合水溶液,施药液量为350 L/hm2。分别剪取施药前 (0 d) 及施药后2、4、6 d 的耳叶水苋叶片,液氮处理后于 −80 ℃下储存备用。设计荧光定量PCR所需的内参基因β-actin和目的基因的引物 (表3),引物由英维捷基公司合成。在做荧光定量PCR之前先对引物进行普通PCR验证,通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带是否具有单一性 (特异性扩增);然后进行内参基因与目的基因的融解曲线分析和引物的扩增效率验证,如果引物合适,反应的特异性良好,则融解曲线是单峰,扩增效率在90%~105%之间。分别取2种生物型药前和药后不同时间的样品,提取RNA后合成的28个cDNA样品,每个样品3次重复,设阴性对照,扩增目的基因和内参基因。

      表 3  实时定量PCR的引物序列

      Table 3.  The sequences of primers for Real Time Quantitative PCR

      基因
      Gene
      引物
      Primer
      序列
      Sequence (5′—3′)
      Tm
      Tm value
      扩增长度
      Amplification size/bp
      β-actinAction-F-2TGGCATCACACTTTCTACAA54220
      Action-R-2ACACCATCACCAGAATCG56
      ALSALS-FGGACACTGACATGGACT59220
      ALS-RCGCTACGTAACGGCATGACAGTG57

      采用公式2△△Ct 计算ALS相对表达量,其中Ct 值是样品到达域值时所经历的循环数。ALS基因表达量的差异用施药后不同时间处理组相对于对照组的表达量的倍数来表示。△△Cts=△Cts−△Ctc,其中:s为测定样本,c为校准样本。△Ct 为ALS的Ct 值减去actin的Ct 值。校准样本选耳叶水苋敏感生物型对照组0 d的样本。应用统计软件SPSS13.0进行数据统计分析。试验方法参考文献方法[17]

    • 表4可以看出,耳叶水苋生物型JX110对苄嘧磺隆产生了高水平抗性 (RI 67.90),JS039和NB0143-05产生了中等水平抗性,而AH014则产生了低水平抗性。而且,对苄嘧磺隆表现中高水平抗性的JS039、NB0143-05和 JX110 3种生物型对五氟磺草胺均表现为低抗,对双草醚以及咪唑乙烟酸也表现为低抗或敏感性降低。

      表 4  不同耳叶水苋生物型对4种ALS抑制剂的抗性水平

      Table 4.  Resistance level of different A. arenaria biotypes to four ALS inhibiting herbicides

      药剂
      Herbicide
      生物型
      Biotype
      鲜重抑制中剂量
      ED50/(g/hm2)
      抗性指数
      Resistance index
      苄嘧磺隆
      bensulfuron-methy
      HZ0010.180 ± 0.1401.00
      JS0393.16 ± 0.5417.6
      JX11012.2 ± 1.867.9
      NB0143-058.02 ± 0.9844.6
      AH0141.50 ± 0.298.37
      五氟磺草胺
      penoxsulam
      HZ0010.160 ± 0.2101.00
      JS0390.590 ± 0.0503.73
      JX1100.780 ± 0.1704.96
      NB0143-050.850 ± 0.1005.43
      AH0140.710 ± 0.2104.55
      双草醚
      bispyribac-sodium
      HZ0010.190 ± 0.0301.00
      JS0390.400 ± 0.1302.17
      JX1100.930 ± 0.1605.05
      NB0143-050.850 ± 0.3004.60
      AH0140.670 ± 0.1503.64
      咪唑乙烟酸
      imazethapyr
      HZ0010.250 ± 0.0601.00
      JS0391.03 ± 0.314.16
      JX1100.640 ± 0.1502.60
      NB01431.60 ± 0.126.45
      AH0140.490 ± 0.0801.96
    • 提取的总RNA经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带清晰可见,没有明显的降解情况,说明提取的RNA质量较好。利用RACE PCR技术扩增目的条带。其中3′-RACE扩增结果在 780 bp 左右有单一条带 (图1),与预期779 bp的结果相符;5′-RACE扩增结果在 780 bp 左右有单一条带 (图2),与预期761 bp的结果相符。回收两条目的条带进行连接与转化。挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定,结果扩增出与预期大小相符的特异性条带。

      图 1  耳叶水苋ALS基因3′-RACE的扩增结果

      Figure 1.  The amplification of 3′-RACE of A. arenaria ALS gene

      图 2  耳叶水苋ALS基因5′-RACE的扩增结果

      Figure 2.  The amplification of 5′-RACE of A. arenariaALS gene

      分别利用DNA Lasergene的SeqMan和Editseq软件对耳叶水苋ALS基因片段进行拼接,获得了全长核苷酸序列2 235 bp,编码667个氨基酸。将耳叶水苋敏感生物型HZ001的ALS基因序列及其编码的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST比对分析,发现其与十字花科的播娘蒿Descurainia sophia、菊科的小白酒草Conyza canadensis相似度最高,达到86%;其次,与菊科的向日葵Helianthus annuus、十字花科的拟南芥Arabidopsis thaliana、野萝卜Raphanus raphanistrum和油菜Brassica napus 相似度达85%。说明获得的是耳叶水苋ALS基因序列。采用MegAlign软件进行序列分析,发现敏感生物型HZ001非保守区第93位亮氨酸与拟南芥一致,而3种抗性生物型JS039、JX110和NB0143-05中该位点均被脯氨酸取代 (表5),保守区序列未见突变。

      表 5  耳叶水苋抗苄嘧磺隆与敏感生物型 ALS 氨基酸序列比较

      Table 5.  Comparison of ALS amino acid sequences between the bensulfuron-methyl resistant and susceptible biotypes of A. arenaria

      生物型
      Biotype
      以拟南芥为参考的氨基酸位点
      Amino acid position relative to Arabidopsis thaliana
      899398
      HZ001 TCC CGG TTC GGC CTC GAT GAG CCC CGC AAA
      S R F G L D E P R K
      JS039 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
      S R F G P D E P R K
      JX110 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
      S R F G P D E P R K
      NB0143-05 TCC CGG TTC GGC CCC GAT GAG CCC CGC AAA
      S R F G P D E P R K
    • 测定结果表明,相比苄嘧磺隆敏感生物型HZ001,生物型NB0143-05的离体ALS酶对该药的敏感性大幅度降低 (表6),抗性指数为37.04。

      表 6  耳叶水苋离体ALS酶对苄嘧磺隆的敏感性

      Table 6.  Susceptibility of ALS enzyme from A. arenaria to bensulfuron-methyl in vitro

      生物型
      Biotype
      回归方程
      Regression equation
      相关系数
      r
      I50 (95%置信限)
      I50 (95% Confidence interval)/(µmol/L)
      HZ001 y = 0.565 9x + 6.755 0 0.999 6 1.92×10−3(8.28×10−4~3.70×10−3)
      NB0143-05 y = 0.332 7x + 5.510 3 0.993 0 0.071 (0.032~0.18)
    • 本研究中目的基因和内参基因的融解曲线均为单峰,说明引物特异性好,阴性对照中没有扩增产物出现。内参基因标准曲线扩增效率在90%~105% 之间,结果较理想。

      ALS表达量相对定量分析结果表明,在未喷药之前 (0 d),耳叶水苋两种生物型的 ALS基因的表达水平很接近 (图3)。清水对照组,ALS基因的表达水平随时间的延长没有明显变化;但苄嘧磺隆 (0.1 g/hm2) 茎叶处理后,2种生物型ALS的表达水平均随时间的延长先升高,药后4 d达到峰值。药剂诱导后2、4和6 d,敏感生物型HZ001的ALS表达量分别是对照的1.23、2.74和2.41倍,而抗性生物型NB0143-05的ALS表达量分别是对照的1.83、4.45和2.72倍,且这3个时间抗性生物型ALS基因表达量均显著高于敏感生物型,抗性生物型ALS基因达到峰值时的表达量是敏感型的1.86倍。

      图 3  耳叶水苋抗苄嘧磺隆与敏感生物型ALS基因在药剂诱导后表达量比较

      Figure 3.  Comparison of ALS gene expression of the bensulfuron-methyl resistant and susceptible biotype of A. arenaria after induced by BSM

    • 本研究表明,对于苄嘧磺隆,耳叶水苋浙江嘉兴生物型JX110产生了高水平抗性 (RI = 67.90),江苏苏州、浙江宁波生物型产生了中等水平抗性,安徽广德生物型产生了低水平抗性。而且,对苄嘧磺隆表现中高水平抗性的生物型对三唑嘧啶磺酰胺类五氟磺草胺、嘧啶硫代苯甲酸酯类的双草醚、以及咪唑啉酮类的咪唑乙烟酸均出现了交互抗性。这说明长三角地区稻田耳叶水苋的抗药性问题已相当严重,且抗性种群分布较广,应引起高度重视。这是国内外耳叶水苋对ALS抑制剂产生交互抗性的首次报道。

      杂草对ALS抑制剂的抗性是当前杂草治理面临的一个挑战,山东胶州麦家公Lithospermum arvense抗苯磺隆 (RI = 2.65) 生物型对苄嘧磺隆 (RI = 2.13) 和噻吩磺隆 (RI = 3.11) 也产生了抗性[18]。本研究发现,不同地区耳叶水苋生物型对ALS抑制剂的抗性水平不同,这可能是由于各地区的药剂选择压不同所致。另外,不同地区生境的不同可导致杂草株高、叶片的形态与表面结构等方面变化,从而导致除草剂在杂草叶片的沉积以及在体内的吸收、传导等方面存在差异。例如,杂草Brunnichia ovata对草甘膦产生耐药性的主要原因是叶片表面蜡质的疏水性较强,降低了药液的沉积和吸收[19]

      本研究获得4种耳叶水苋生物型ALS基因的全长序列2 235 bp,编码667个氨基酸。发现抗性生物型非保守区第93位的亮氨酸被脯氨酸取代,未发现保守区突变;同时发现抗性生物型NB0143-05的ALS酶对苄嘧磺隆的敏感性显著下降,说明靶标酶对药剂的敏感性降低是耳叶水苋产生抗药性的原因之一。然而,第93位突变与抗药性的关系未见报道,是否影响酶的空间结构,从而影响酶与底物的结合以及催化反应,有待进一步研究。另外,本研究发现苄嘧磺隆诱导后2、4和6 d抗性生物型NB0143-05的ALS基因表达量均显著高于敏感生物型,该基因达到峰值时的表达量是敏感型的1.86倍。靶标酶的过量表达也可导致杂草产生抗药性,牛筋草Eleusine indica的ACCase基因表达量上调4倍,其对精吡氟禾草灵抗性达150倍[20],荠菜Capsella bursa-pastoris的ALS基因表达量提高4.69倍,导致其对苯磺隆的抗性达359.3倍[13]。因此,耳叶水苋NB0143-05生物型在苄嘧磺隆诱导后ALS基因的表达量显著高于敏感生物型,从而导致ALS酶在相同除草剂剂量下受抑制程度降低,正常的生理功能受影响减弱,这可能也是其产生抗性的原因之一。当然,是否还同时存在非靶标抗性机制,如细胞色素P450酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性增强还需要进一步研究。

      近20年来,中国的农田杂草防治过于依赖除草剂,加之科学用药知识的普及度不够,稻田苄嘧磺隆、吡嘧磺隆等ALS抑制剂多年连续使用的做法比较普遍,长期的选择压很可能促使了耳叶水苋对4类ALS抑制剂产生抗性。杂草综合治理是发达国家抗药性杂草治理的重要策略,中国应加强这方面的应用基础研究与技术推广。根据耳叶水苋种子顶土能力较弱且萌发需要较高土壤含水量的特性[21],通过翻耕和水旱轮作可有效减轻其危害。此外,本课题组发现:油菜秸秆覆盖可有效地控制稻田耳叶水苋等恶性杂草危害,且提高土地肥力;再者,草酮、灭草松等作用机制不同的除草剂对耳叶水苋也有较好的防效[22]。因此,采取水旱轮作、秸秆覆盖、轮换用药,并结合水层管理等农艺措施,可有效控制耳叶水苋等杂草的危害,延缓抗性的进一步发展,实现稻田杂草的可持续治理。

参考文献 (22)

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